基于抗氧化肽构效关系的研究表明，酸性氨基酸与抗氧化肽减缓油脂氧化显著相关。因此，选择适宜的富含酸性氨基酸的蛋白原料，并确定适宜的蛋白酶类型，可以有目的地制备减缓油脂氧化的抗氧化肽。柠条是豆科锦鸡儿属植物栽培种的统称，柠条籽可以作为酸性氨基酸蛋白原料的重要来源之一。生物信息学是用于管理、规划和解释与生物系统相关信息的计算方法，它利用各种数据库，在线工具和软件等获取目标功能。BIOPEP是一个由波兰WarmiaMazury大学开发的软件工具，它不仅是一个包含蛋白质序列、生物活性肽和敏感肽的数据库，而且也内置了预测程序，可以帮助预测水解蛋白酶的酶切位点。
因此，北京林业大学生物科学与技术学院的頡宇、胡锦灵和张柏林*等人以柠条籽为酸性氨基酸蛋白来源，通过借助BIOPEP筛选适合的蛋白酶类型，从选定的蛋白原料中筛选抗氧化肽，形成一种新的抗氧化肽制备工艺，以期研究定向制备延缓油脂氧化抗氧化肽的新工艺和新策略，为推动抗氧化肽产业化发展提供创新性的理论依据。
1柠条籽主要营养成分
结果显示，柠条籽的蛋白质和碳水化合物含量较为丰富，灰分含量较少。与大豆主要营养成分的含量相比，柠条籽的蛋白质、脂肪、碳水化合物含量均与大豆相似，大豆的粗蛋白质量分数平均为40%，脂肪质量分数约为18%～22%，碳水化合物质量分数为22%～35%。由此看来，柠条籽可效仿大豆进行开发，提供丰富的蛋白资源。
柠条籽蛋白的分子质量集中分布于10～70kDa之间（图1），由柠条籽中分离所得的谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白、清蛋白，4种类型蛋白与柠条籽蛋白分布相同，其中谷蛋白的分子质量分布与柠条籽蛋白最为贴合，因此可以得出谷蛋白是柠条籽蛋白的主要蛋白类型。谷蛋白中以谷氨酸含量最为丰富，通过测定柠条籽蛋白中的氨基酸组成及含量，证实了谷氨酸和天冬氨酸是其含量最高的2种氨基酸，分别为4.4%和2.5%，说明柠条籽蛋白是制备富含酸性氨基酸抗氧化肽的理想蛋白原料。
2水解酶的选择
本研究以谷蛋白作为柠条籽蛋白的生物信息模板，在BIOPEP数据库内搜索已知谷蛋白序列5条，并选择木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、V-8蛋白酶、木瓜蛋白酶＋V-8蛋白酶分别对5条谷蛋白序列虚拟水解，选取水解度较高的蛋白酶水解柠条籽蛋白。木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶均为水解植物蛋白时常用的蛋白酶。结果显示，木瓜蛋白酶对几种谷蛋白的水解度均超过40%，而胃蛋白酶、胰蛋白酶的水解度平均为10%。这是由于木瓜蛋白酶具有更广泛的水解位点，根据BIOPEP的数据，木瓜蛋白酶的酶切位点主要是蛋白N端的谷氨酰胺和丙氨酸，蛋白C端的精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸及苏氨酸；胃蛋白酶主要作用于蛋白C端的苯丙氨酸和亮氨酸；胰蛋白酶切割位点为蛋白C端的赖氨酸和精氨酸。所以，木瓜蛋白酶的水解度较其他两个蛋白酶更高一些，本实验将选用木瓜蛋白酶作为主要蛋白酶来水解柠条籽蛋白。
为制备富含酸性氨基酸的抗氧化肽，实验还选取了酶切位点为蛋白C端谷氨酸和天冬氨酸的V-8蛋白酶，与木瓜蛋白酶共同水解柠条籽蛋白。经在线软件虚拟水解，木瓜蛋白酶与V-8蛋白酶复合对水解度的提高影响不大。
为验证数据库软件模拟结果并确定V-8蛋白酶的添加量，将V-8蛋白酶以0%的添加量为起始，与木瓜蛋白酶进行复配，以10%为增加幅度，不断增加添加量至与木瓜蛋白酶等量即50%，对柠条籽蛋白进行水解，所得的水解度、蛋白水解物的亚油酸氧化抑制率如图2所示。
从水解度方面看，只添加木瓜蛋白酶时，水解度为34.8%，接近40%，与数据库软件模拟得到的结果类似。而V-8蛋白酶的加入对水解度没有提高，这与模拟结果相同，说明数据库软件模拟结果是可信的。加入10%V-8蛋白酶后水解度为34.9%，随着V-8蛋白酶的逐渐增加，水解度未升高反而有所下降（图2），说明木瓜蛋白酶的减少对水解度有一定影响，因此用木瓜蛋白酶作为主要水解蛋白酶是正确的。
从亚油酸氧化抑制率方面看（图2），未加入V-8蛋白酶时，木瓜蛋白水解物的亚油酸氧化抑制率为38.9%，而加入10%V-8蛋白酶后，亚油酸氧化抑制率提升至57.4%，但随着V-8蛋白酶的添加量增加，其亚油酸氧化抑制率却没有再提高。
综合上述两方面的数据，数据库软件模拟水解可以应用于筛选目标蛋白酶，且V-8蛋白酶的加入确实有助于提高蛋白水解物的抗油脂氧化活性。据此，本实验将选用木瓜蛋白酶为主要蛋白酶，并复配10%的V-8蛋白酶作为辅助，定向水解柠条籽蛋白，以获得高活性抗氧化肽。
3最佳水解工艺的确定
本研究确定选用木瓜蛋白酶和V-8蛋白酶共同作为水解酶，以水解度为指标，讨论温度、pH值、水解时间以及酶添加量4个因素对水解效果的影响，在单因素试验的基础上，进行4因素3水平的正交试验，并以亚油酸氧化抑制率为评价指标，确定最佳的水解工艺。
如图3a所示，温度对水解效果影响较大，随着温度不断升高，水解度不断增加，55℃达到最大值，继续升高则水解度下降，表明最适水解温度为55℃。如图3b所示，pH值对水解效果影响较显著，各类蛋白酶等电点不一样，均有最适pH值范围，只有在最适范围内，酶的活性才能达到最大值。结果表明，木瓜蛋白酶与V-8蛋白酶的组合水解的最适pH值为6.0。如图3c所示，随着水解时间的延长，水解度呈缓慢增长趋势，3h时达到最高值。如图3d所示，随着酶与底物浓度之比的增加，水解度先增加后减小，酶添加量为2%时，水解度最高，随后呈下降趋势。
通过正交试验的结果分析，最优水平为A1B1C2D1，即温度45℃、pH5.0、时间2h、酶添加量1%，与图3单因素试验中以水解度作为水解效果指标得到的结果，正交试验的工艺条件均降低了一个水平，这说明仅用水解度为评价指标优化柠条籽蛋白水解工艺条件是片面的，高水解度会导致蛋白水解物中含有较多的游离氨基酸，不利于制备具有特定功能的小分子肽，应配合抗氧化能力大小对水解效果进行综合评定。所以本研究以亚油酸氧化抑制率作为优化水解柠条籽蛋白的指标是正确的。
根据极差结果，影响亚油酸氧化抑制率的因素顺序为：酶添加量＞时间＞pH值＞温度。由方差分析也可看出，酶添加量对柠条籽蛋白的水解效果具有显著性差异，水解时间与pH值次之，具有较显著差异，温度的影响较小，方差分析显示结果差异不显著。
4柠条籽抗氧化肽油脂抗氧化评价
利用优化水解工艺得到柠条籽蛋白水解物，经液相色谱-质谱联用及软件分析，鉴定到多肽序列条，其中包含数据库软件模拟活性片段的序列占90%，这些多肽序列中含有30%以上酸性氨基酸的序列约占40%。表8列出了部分柠条籽多肽序列，可以看出，这些序列都包含了虚拟水解得到的活性片段Q、QE、QYE、E、D、AE、QG等。
实验选取了一条包含活性片段的柠条籽抗氧化肽LDEPDPL进行油脂抗氧化的评价。亚油酸体系的自动氧化反应常作为油脂抗氧化的评价。如图4所示，柠条籽抗氧化肽的亚油酸氧化抑制率可达到50.3%，与同等浓度化学抗氧化剂TBHQ有类似效果，说明根据数据库软件虚拟水解结果筛选抗氧化肽是一种可行的方法。
讨论
综上，本研究结论如下：1）选择富含酸性氨基酸的柠条籽蛋白，结合计算机辅助水解法可以筛选延缓油脂抗氧化肽的蛋白酶组合，即木瓜蛋白酶＋10%V-8蛋白酶；该组合酶的水解度为34.9%，适宜水解条件为温度45℃、pH5.0、时间2h和酶添加量1%。经过此水解工艺获得的抗氧化肽LDEPDPL的亚油酸氧化抑制率为50.3%，与相同浓度化学抗氧化剂TBHQ有类似的抗氧化效果。2）通过选择富含酸性氨基酸的蛋白来源，结合生物信息手段筛选目标蛋白酶，可以建立定向制备延缓油脂氧化的抗氧化肽工艺，获得目标抗氧化肽，这种工艺不仅简化了抗氧化肽的制备方式，而且为利用柠条籽蛋白开发抗氧化活性肽提供了依据。
本文《基于生物信息学定向制备柠条籽蛋白抗氧化肽的工艺优化》来源于《食品科学》年41卷20期-页，作者：頡宇，胡锦灵，赵宏飞，张柏林。DOI:10./spkx---。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
近期研究热点
酪蛋白与可溶性大豆多糖的酶促糖基化产物制备及其性能分析果胶/酪蛋白酸钠复合运载体系的构建及对番茄红素的控释机理基于高通量测序技术对茅台镇酱香白酒主酿区域酵母菌群结构多样性的解析酱油酿造用耐盐产乙醇风味酵母的选育及其应用菌种对发酵红茶水溶液香气品质的影响产琥珀酸菌LW-2的筛选、鉴定及发酵条件优化发酵剂对发酵香肠蛋白质降解及多肽抗氧化能力的影响盐渍辣椒细菌多样性分析脂肪含量对牦牛乳硬质干酪质构、流变和微观结构的影响射频处理提高米糠稳定性及其对品质的影响八角水溶性膳食纤维对油脂乳液消化特性的影响小球藻多糖的分离纯化及理化性质高筋粉添加量对油塔子品质的影响pH值对麦醇溶蛋白-槲皮素相互作用及其Pickering乳液特性的影响超微粉碎对4种杂粮粉理化性质及功能特性的影响分段式远红外-热泵干燥对龙眼品质的影响超声处理对鲫鱼皮胶原蛋白的自组装行为和理化性质影响真空协同大豆分离蛋白复合冷冻保护剂对速冻饺子馅品质的影响抗菌肽brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌的协同抑菌机理10种植物精油对腐生葡萄球菌抑制效果比较及肉桂精油抑菌机制分析基于深度置信网络-多类模糊支持向量机的粮食供应链危害物风险预警修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅图片来源于摄图网预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇